Cell 2019 | 深度学习揭示全身癌症转移和治疗性抗体靶向

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📝Introduction|深度学习揭示全身癌症转移和治疗性抗体靶向

研究背景(Background):

癌症的转移过程极其复杂，几乎涉及全身各器官。大多数癌症患者死于远端转移灶，这些灶由具有原发或获得性耐药性的播散癌细胞发展而来。要更深入理解转移机制以及药物靶向效果，必须能在整体动物模型中全面、无偏差地检测癌细胞及治疗药物

研究问题和动机(Gap & Motivation)：

当前缺乏可可靠检测小范围甚至单个癌细胞的全身成像技术，主要因为传统荧光蛋白（GFP/YFP/mCherry）在组织高自发荧光下信噪比低。人工标注高分辨率全身图像成本极高（数月/只小鼠），传统基于滤波器的3D检测器存在高误报与漏报问题，尤其因不同组织对比度差异显著。亟需一种高灵敏、高通量、低人为干预的成像与分析手段，来大规模研究肿瘤转移及靶向治疗的效果。

研究内容与贡献(Objective & Contribution）：

为了解决上述问题，研究构建了一套基于深度学习和vDISCO成像的全自动分析流程——DeepMACT。（做了什么工作）

具体而言DeepMACT是一个深度学习模型集合，vDISCO 技术可将荧光信号放大100倍以上，有效提升成像灵敏度。结合 CNN 的图像分析算法，，用于自动量化转移，提升自动识别转移灶的准确性与效率。。（方法效果怎么样，解决了什么问题）

通过 DeepMACT 在包括乳腺癌、肺癌和胰腺癌在内的5种不同转移性癌症模型中进行量化，这些癌症具有不同的器官趋向性。并成功评估了抗 CA XII 抗体的转移灶靶向效率。（有什么结果，发现重要吗）

🗺️方法

小鼠模型

Spontaneous breast cancer metastasis model

Estrogen positive breast cancer model and brain metastatic lung cancer model

Pancreatic cancer model

Model Type	中文名称	小鼠品系	关键特征
Spontaneous breast cancer metastasis model	自发性乳腺癌转移模型	NSG (NOD/SCID/IL2Rγ KO) mice（NSG免疫缺陷小鼠）	- 高度免疫缺陷（T/B/NK细胞缺失）- 适用于人源肿瘤异种移植（PDX）- 采用原位乳腺脂肪垫注射（MDA-MB-231细胞）或心内注射研究转移
Estrogen positive breast cancer model and brain metastatic lung cancer model	雌激素阳性乳腺癌模型 & 脑转移性肺癌模型	NMRI nu/nu mice（NMRI无胸腺裸鼠）	- T细胞缺陷，B/NK细胞部分保留- 心内注射MCF-7（雌激素依赖）或H2030-BrM3（肺癌脑转移）- 需监测生物发光信号
Pancreatic cancer model	胰腺癌模型	Wild-type C57BL/6 mice（野生型C57BL/6小鼠）	- 免疫系统完整- 原位胰腺注射（KPC来源的R254细胞）- 适合研究肿瘤微环境与免疫互作

数据标注

数据注释分为自动标注和人工修正两个阶段，自动标注使用自定义滤波器和3D卷积进行初步标注，随后专家通过开发的交互式工具进行快速修正。为了提高标注一致性，数据集的部分内容进行了多次标注和人工复核，重点修正漏标的转移瘤（假阴性）。最终，结合深度学习和人工修正，生成了高质量的标注数据。通过开发工具将注释时间从几个月缩短至150个工时。

基于深度学习的转移检测

DeepMACT 模型架构

该模型灵感来源于U-Net，采用7层的编码-解码结构。每一层包含跳跃连接、卷积操作、批归一化（Batch Normalization）和ReLU激活函数。编码单元通过最大池化操作将分辨率减半，解码单元通过空间上采样和与相应编码单元的特征拼接进行处理。最终解码器将输出映射为二维空间的logits。

自定义3D U-Net的实现

为了与DeepMACT进行比较，采用了3D U-net版本，将2D卷积替换为3D卷积。最佳表现的模型使用3层编码-解码单元，最大特征通道数为48，此外还有不同参数的其他变种

训练集、验证集和测试集（划分）

采用k折交叉验证（k=5）方法，将数据集划分为训练/验证集（80%）和测试集（20%）。训练和验证集用于优化模型超参数，以避免过拟合。数据仅限于小鼠躯干内的子体积，排除了主肿瘤、辅助淋巴结和受污染的数据，占总扫描体积不到1%。数据划分在子体积级别进行，以避免信息泄漏。

训练过程

训练流程：

初步训练：通过k折交叉验证（k=5）训练多个模型，测试不同超参数，进行10个epoch的训练。
优化超参数：选择表现最佳的超参数，继续训练剩余epoch，直到40个epoch。

数据增强：使用随机垂直和水平翻转来增强数据多样性。

输入归一化：根据局部子体积峰值归一化效果最好。

损失函数：采用加权二进制交叉熵，前景（FG）像素权重较大，以应对类别不平衡。

训练数据优化：仅使用包含前景的90%训练数据，提升验证集表现。

优化器和学习率：

使用Adam优化器，初始学习率为10^-4。
每2个epoch损失不下降时，学习率降低10倍，最小至10^-7。

训练时间：40个epoch训练时间约为20-30分钟，使用NVIDIA Titan XP GPU的工作站。

测试和过程推理模式

研究采用了k折交叉验证，k=5

训练好的算法用于生成来自三个投影视角（PXY、PYZ、PZX）的概率掩膜，每个像素值表示网络对该像素是否为转移的信心。通过将三个二维概率掩膜组合成三维空间，得到了最终的分割掩膜。默认的置信度阈值设置为50%

使用连通组件分析找出并分割出转移区域。

性能评估

采用F1分数进行性能评估，F1分数结合了精准度（预测为正的正确比例）和召回率（实际为正的正确预测比例），等同于Sørensen–Dice系数，常用于图像分割任务

性能评估使用全体测试集，并通过自助法（n=1000次重采样）估算结果的变异性。通过与人工标注者绘制的三维轮廓比较，验证了转移癌的三维分割的准确性，最差分割的重叠精度为90%，90%的转移癌的分割精度达到97.5%以上。

转移灶分析

器官配准 | 手动分割感兴趣的区域

使用Fiji软件手动分割感兴趣器官（肺、脑、肾、心脏、肝脏）的3D轮廓。

采用自定义Python脚本检测转移灶质心是否位于这些器官的3D分割中，未归属的转移灶标记为“躯干其他部分”。

计算肺部体积，并评估肿瘤密度，作为转移灶在肺部的比例。

药物靶向分析

通过分析转移灶内与周围区域的荧光信号分布，评估6A10抗体的靶向效果。

计算转移灶内外信号强度的比值（抗体信号比率），若比率大于1，表示靶向效果显著。

使用Welch t检验评估转移灶与周围区域信号强度差异。

荧光信号特征分析

研究不同激发波长下的荧光信号轮廓（470 nm, 561 nm, 647 nm）。

对肺部转移灶使用uDISCO和vDISCO清除后进行图像采集，分析信号与背景的信号比（SBR）。

标准化后的信号轮廓进行比较，绘制代表性图表。

转移灶直径与血管距离

手动验证转移灶的直径。

随机选择转移灶边界的10个点，测量到最近血管的距离，计算平均值，生成转移灶与血管的距离散点图。

🍎结果

光学透明化小鼠癌症转移的 vDISCO 成像 | 成像效果

通过移植表达荧光标记的肿瘤细胞，结合 vDISCO 荧光增强技术 与 光片显微镜成像，研究者在全身水平上可视化了单个微转移灶。随后，利用深度学习算法对整个小鼠的3D图像堆栈进行分析，自动检测和分割癌细胞信号，显著提升了微小病灶识别的灵敏度和空间分辨率，优于传统生物发光成像方法。

深度学习用于检测和量化转移 | 分割性能对比

DeepMACT使用类似U-net的CNN架构，通过编码和解码单元提取癌症特征并进行像素级分割

通过与传统滤波器检测方法和人工标注员进行对比，DeepMACT在转移检测上表现优异，F1分数达到80%，接近人类专家的表现，并显著提高了检测速度。

DeepMACT能够在几个小时内完成通常需要几个月的工作，大大提高了工作效率。该方法支持调整精度与召回率的平衡，适应不同需求，提高了检测的灵活性和实用性。

DeepMACT在不同肿瘤模型中可靠检测微转移灶 | 不同组织、时间点及多种肿瘤模型中的表现

DeepMACT 技术在整鼠体内高灵敏度检测微转移瘤（micrometastases）的能力，涵盖其在不同组织、时间点及多种肿瘤模型中的表现。DeepMACT 不仅可定量分析微转移灶的空间分布、大小及细胞数，还能胜任传统成像方法难以实现的器官区域（如脑、骨）的检测,提升了对肿瘤转移过程的理解和追踪能力。

研究者使用该方法对整只小鼠进行分析，发现 520 个微转移瘤，其中 306 个在肺部。大部分微转移瘤位于 深层组织，距离表面约 1 cm，这使得传统方法难以检测。

肺部的微转移瘤在 所有肺叶 中均匀分布，且与 大小无关，表明这些微转移瘤是由多个独立转移事件所形成。此外，微转移瘤的大小差异较大，虽然大部分彼此距离较近（<1 mm），但也存在 最大距离达 9.3 mm 的孤立病灶。

进一步分析发现，很多微转移瘤的 细胞数仅为几百个或更少，直径 小于 50–100 μm，这些微转移瘤非常难以通过传统方法被检测到。同时，肺部转移灶的负荷远大于躯干，且 肺部微转移瘤平均比躯干大 30%，细胞数是躯干的 2 倍以上。

为验证 DeepMACT 的准确性，研究者首先进行了负对照实验，发现肿瘤细胞在未形成转移前，透明化过程不会导致伪阳性。

DeepMACT 可在不同鼠种、肿瘤类型中有效检测转移灶,包括免疫缺陷和免疫正常小鼠。测试了三种不同肿瘤模型：

MCF-7 模型：肺、肝、肾、骨、脑均有转移
R254 模型：主要在肺、肝和腹膜
H2030-BrM3 模型：脑为主要转移位点（31 个灶）

研究者进一步研究了转移过程在不同时间点的演变，使用 MDA-MB-231 乳腺癌细胞注射到小鼠心腔后，分别在 2天、6天和14天 时分析，结果显示，转移灶数量随着时间的推移持续增加，且肺部始终是转移最集中的器官。

DeepMACT 揭示单个微转移灶水平的治疗性抗体靶向情况 | 抗体分布全身定量分析结果

研究对象为靶向人类碳酸酐酶 XII（CA12）的单克隆抗体 6A10，已知具有抑制肿瘤生长及增强化疗敏感性的作用。实验中，研究者在移植 MDA-MB-231 乳腺癌细胞 9 周后，通过静脉注射给予 20 μg Alexa-568 标记的 6A10，并于 2 天后取材分析其分布。

抗体 6A10 可有效聚集于原发肿瘤和某些转移灶（如腋下淋巴结和肺部）。

但不是所有微转移灶都能被抗体靶向，存在异质性（例如肺内部分靶向成功，部分没有）。肺部微转移灶中，85% 被成功靶向；而其他部位为 66%；抗体信号在肺部灶中更集中，分布也更均匀。

大小相关性：大尺寸微转移灶更可能被抗体靶向（88%）；小尺寸灶的靶向率则为 67%。

非特异性结合：尽管抗体不与小鼠 CA12 结合，但仍观察到一些 off-target 结合，推测是非特异性结合造成的。

抗体药物未能完全靶向微转移灶（micrometastases）的潜在机制

抗体药物在某些情况下未能靶向多达 23% 的微转移灶。研究的目标是理解这种“漏靶”现象的可能机制。

研究者考虑是否因为某些微转移灶没有邻近的血管，导致药物无法输送到位。他们使用 lectin 染色对肺部组织进行标记分析，发现所有的微转移灶都靠近血管，距离仅为 1–6 μm，远小于一个细胞直径（~10 μm）。因此，药物输送路径不足不是主要问题。

研究者转向分析肿瘤微环境是否影响抗体药物的靶向能力。利用深度学习方法（DeepMACT）研究靶向灶与未靶向灶在空间上的分布关系。结果表明，靶向成功的灶更容易聚集在一起（平均距离 ~0.8 mm），而未靶向灶则分布更分散（距离 ~1.7–2.0 mm）。这种非随机分布提示，某些局部微环境可能会影响抗体的识别或渗透。

🐿️结论

略

🤗心得体会

不是分割完了就完事了，分析其实占了工作量的大多数。

mouse whole body的分析结果才是我们最应该关注的，但是限制于存储和计算成本，只能先把大图打伞，在小的图上做，最后拼接，这些都是时间成本。

也需要注意不同方法处理时间开销的比较，不要偷懒。

结果部分至少应该是4~5小段，在写的时候可以是预期的结果。

引用

下期预告

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下期预告：

Chen, Y., Al-Maskari, R., Horvath, I., Ali, M., Hoher, L., Yang, K., ... & Erturk, A. (2025). SELMA3D challenge: Self-supervised learning for 3D light-sheet microscopy image segmentation. arXiv preprint arXiv:2501.03880.