bioRxiv 2024|深度学习与三维成像揭示肥胖对全身的影响

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bioRxiv 2024|Deep Learning and 3D Imaging Reveal Whole-Body Alterations in Obesity

作者单位是德国Helmholtz Center Munich的Institute for Intelligent Biotechnologies (iBIO), 下面作者对文章的贡献相同: Doris Kaltenecker, Izabela Horvath, Rami Al-Maskari, Zeynep Ilgin Kolabas,Ying Chen.

论文标题：Deep Learning and 3D Imaging Reveal Whole-Body Alterations in Obesity

论文地址：https://www.nature.com/articles/s41587-024-02528-1

项目主页：https://discotechnologies.org/MouseMapper/

GitHub仓库：https://github.com/erturklab/mouseMapper

📝Introduction|深度学习与三维成像揭示肥胖对全身的影响

研究背景(Background):

许多疾病（如肥胖等由生活方式引起的疾病）会对身体多个器官系统产生广泛影响，反映了身体生理系统的高度互联性。因此，需要整体性的研究方法来理解疾病所引发的病理变化。近年来，组织透明化技术和光片荧光显微镜（LSFM）使得我们能够在单细胞分辨率下观察整只小鼠甚至较大的人体样本，为全身尺度的成像提供了可能。

研究问题和动机(Gap & Motivation)：

尽管现有成像技术已经可以对整只动物进行高分辨率成像，但在图像分析层面仍存在明显短板，尤其是缺乏能在全身尺度上对细胞结构和细长结构（如神经）进行定量分析的工具。这限制了我们发现组织结构变化区域的能力，也阻碍了对疾病系统性影响机制的进一步分子层面研究。此外，肥胖带来的慢性炎症和代谢功能障碍，与多种严重疾病密切相关，其系统性危害性突显了深入研究其全身性结构与细胞变化的必要性。

研究内容与贡献(Objective & Contribution）：

为了解决上述问题，作者开发了一种名为 MouseMapper，用于解决肥胖等全身性疾病的全局影响分析问题。（做了什么工作）

具体而言MouseMapper是一个深度学习模型集合，包括三个主要模块：神经模块、免疫模块和组织模块。神经模块用于分割整个小鼠体内的神经，免疫模块用于分割CD68+免疫细胞，组织模块用于将分割的结构映射到整个小鼠体内的器官和组织。使用MouseMapper，我们以高空间分辨率识别了神经和免疫细胞网络在多种属性上的结构变化。（方法效果怎么样，解决了什么问题）

肥胖小鼠全身神经分割揭示了肥胖症中眶下神经的结构变化。以及分析了全身性炎症变化（有什么结果，发现重要吗）

🗺️方法

数据标注

使用 syGlass 虚拟现实软件，在3D扫描图像中直观地查看和标注小鼠体内的细胞和组织。UCHL1-EGFP转基因小鼠用于神经可视化和CD68-EGFP转基因小鼠用于免疫细胞可视化。

总共标注了10只小鼠，其中6只是 CD68-EGFP 小鼠4只是 UCHL1-EGFP 小鼠。每种小鼠线里5只是吃正常饮食的（对照组）5只是吃高脂饮食的（实验组）。

在VR环境中手动标注以下组织：

外周神经

三叉神经图像

CD68+免疫细胞

器官组织：脂肪、肌肉、骨、骨髓等

基于深度学习的外周神经分割（神经模块）|神经分割模型

数据集准备

35 个标注好的来自全身神经的patches → 28个训练 / 7个测试

7 个标注好的三叉神经patches→ 5个训练 / 2个测试

即测试使用 7 个全身神经补丁 + 2 个三叉神经图像

三叉神经训练图像裁剪成与其他patches相同尺寸（300³），共获得 565 个 300×300×300 的训练补丁

预处理

对每个patch进行 按样本百分位标准化：

设定 0.5% - 99.5% 为强度范围
超出范围的值进行裁剪（clipping）

然后执行 Min-Max归一化

目的：增强对比度、去除异常值，强化神经区域可见性，提高模型效果

模型训练与选择

尝试了多个架构：Attention UNet、NNFormer、SwinUNETR、UNETR、VNet、3D UNet；128x128x128 voxels, initial learning rate of 1e-3, SGD Optimizer, learning rate decay and Binary Cross Entropy + DICE loss for 1000 epochs. 最终选择表现最优的 3D UNet

使用 nnUNet pipeline 对 3D UNet 进行最终训练，使用参数：patch size = 128³，学习率 = 1e-3，优化器 = SGD，损失函数 = BCE + DICE，训练 = 2000 epoches, clDICE loss（权重 0.5），以强化神经的拓扑和连通性建模

基于深度学习的CD68-EGFP+细胞（免疫模块）分割 | 细胞分割模型

训练时测试了多个网络结构：3D UNet、VNet、Attention UNet、NNFormer、UNETR

使用 nnUNet pipeline 进行训练

Patch 大小为 128×128×128 体素

使用通道级的 Min-Max 归一化

初始学习率为 0.001，使用 SGD 优化器和学习率衰减

共训练 1000 个 epoch

采用 5 折交叉验证进行训练

评估指标包括 voxel DICE、instance DICE 和 Betti Matching

最终根据其中两个指标的表现，选择 3D UNet 用于后续分析

全身器官和组织分割（组织模块）|器官和组织分割模型

总流程

组织模块分为两个任务：器官分割与软组织（肌肉、脂肪）分割

器官分割模型基于6只CD68小鼠训练，评估于4只UCHL1小鼠，最终使用3D UNet模型

软组织模型在逐步扩展的387个样本上训练，同样选择3D UNet作为最优模型

Inference流程采用“先器官后组织”的两步方法，最终实现对全鼠器官与组织的分割

器官分割模型训练

使用6只标注的 CD68-EGFP 小鼠训练了五种模型（3D UNet、VNet、Attention UNet、NNFormer、Swin UNETR）进行内脏器官分割。

使用 nnUNet pipeline 训练，采用 z-score 归一化、前景过采样、SGD 优化器、batch size 为2，patch 大小为 64×256×128，初始学习率 0.01，训练1000轮。

在4只 UCHL1 小鼠上进行评估，采用5折交叉验证并集成5个模型的结果。最终表现最好的模型为3D UNet。

软组织（肌肉和脂肪）分割模型训练

用推理+人工修正方式扩展训练集至387个样本

训练了 3D UNet、VNet、Attention UNet 和 UNETR，使用5折交叉验证，训练参数为：batch size 2，patch 大小 128×128×128，初始学习率 0.001，SGD优化器，训练1000轮。

最终表现最好的仍为3D UNet

组织模块inference流程

推理分为两步：先器官分割，后软组织分割

原始图像先降采样用于器官分割，结果再用来生成“非器官区域”

非器官图像裁剪为小块输入组织网络，最后拼接还原整体结构

UCHL1-EGFP小鼠whole body inference | 全鼠的神经系统分析量化

加速Inference过程、数据处理和定量分析，研究小鼠全身神经的分布和密度。

使用滑动窗口推理方法和ZARR文件格式，结合DASK并行计算框架，高效处理小鼠全身扫描数据，确保快速分析。

在Inference之前，研究者对每个扫描图像进行了百分位归一化，通过计算0.10th百分位和99.9th百分位来设置最小和最大阈值，

推理后的全身神经分割结果进行了连通成分分析，去除了由高强度区域（如小鼠身体内的某些部位）引起的大型伪阳性区域，

研究者从全身、个别组织、特定器官三个角度进行了神经体素和密度的定量分析。为了计算全身神经体素，他们结合了组织分割模块中的器官和组织分割结果，创建了一个覆盖整个小鼠身体的二值掩码。然后通过扩展该掩码，计算了神经体素和密度。

定量分析头部神经，研究者通过将大脑掩码与全身掩码叠加，创建了一个精确的头部神经掩码，从而能够准确计算头部区域内的神经体素。

CD68-EGFP小鼠的whole body inference | 全鼠的免疫细胞分析量化

检测全身小鼠扫描图像中CD68-EGFP阳性细胞的分布，分析不同饮食组（Chow组与HFD组）之间的差异。

从LSFM图像中裁剪出自发荧光和CD68通道的区域，使用与组织分割时相同的patch大小和分布，只保留位于小鼠体内的patch用于后续分析。

对裁剪后的patch使用CD68+分割网络，得到二值mask。通过cc3d库进行连通成分分析，提取每个检测到的cluster的位置信息、体积、质心和形状。根据质心位置将cluster归类到内部器官或组织中。去除不在这些区域内的cluster，以及形状过细长的（可能是血管或神经伪影）。

接着，将cluster按照体积分类。对每只小鼠及其器官，分析不同体积等级的cluster占比，比较Chow组和HFD组之间的差异。CD68分割网络在某些未见过的新组织上仍能有效推理，表现出零样本迁移能力。

为了验证结果，进行目视检查和使用VR标注的手动检查，并与自动分割结果比较，只有DICE评分大于65%的数据被纳入分析。

生化实验材料和步骤，组学分析和生信方法

略。

🍎结果

可视化肥胖中的神经和免疫系统

使用MouseMapper对两种小鼠，一种标记外周神经（UCHL1-EGFP小鼠），另一种标记免疫细胞（CD68-EGFP小鼠），三维可视化小鼠的外周神经系统和免疫细胞分布，发现肥胖小鼠体内神经束在皮下脂肪及内脏器官中延伸，而免疫细胞则显著浸润于肝脏和内脏脂肪组织

MouseMapper全身分析

MouseMapper的三个模块（Nerve Module， Immune-Module和Tissue-Module）为肥胖诱发的神经与免疫变化提供了一个全面的定量分析工具集。

NerveModule通过在虚拟现实（VR）中对UCHL1-EGFP小鼠的神经进行标注，并使用3D UNet深度学习模型进行训练和测试，表现出最佳的分割性能。最终模型的Dice系数为0.7913 ± 0.1423，展示了较好的神经分割效果。

Immune-Module通过对CD68-EGFP+免疫细胞进行标注并使用3D UNet模型训练，获得了比其他深度学习网络更好的表现。该模型展示了零样本推理能力，能够在未见过的组织（如肝脏和肠道）中成功分割免疫细胞。

Tissue-Module用于器官与组织的分割，通过优化训练数据（包括使用降采样图像）来提高计算效率。通过对小鼠的20个器官进行标注，模型表现出色，尤其在器官的综合分割上。对于脂肪和肌肉组织的分割，需要使用全分辨率数据以准确检测组织纹理。

通过整合这三个模块，MouseMapper能够生成一个全面的全身解剖图，揭示肥胖小鼠的脂肪组织（包括内脏脂肪和皮下脂肪）和肝脏体积显著增加，淋巴结质量也有所增加。这为跨区域的定量分析提供了统一的参考框架。

肥胖相关的面神经行为缺陷相伴随的结构性变化 | 外周神经的变化

这项研究通过使用MouseMapper技术，详细分析了肥胖对小鼠外周神经的结构和功能影响。研究发现，肥胖小鼠的脂肪组织中神经数量显著增加，头部神经数量减少，并且眶下神经的结构发生了变化。通过对神经网络复杂性的量化分析，研究表明肥胖导致神经末梢、连接和复杂性的显著减少，同时也发现肥胖小鼠在胡须刺激测试中的反应减弱，提示肥胖可能引起感觉功能障碍。这些发现强调了肥胖对面部神经的结构和功能的潜在影响。